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KDHPTM CRISPR/CasRx Vector Kit
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-11-10 | 653 次瀏覽 | 分享到:
產品簡介
CRISPR/Cas13是繼CRISPR/Cas9之后新發現的一類核酸酶系統,與Cas9靶向DNA不同,Cas13可以特異靶向RNA,實現對RNA的敲低、定點編輯、剪切調控和檢測清除等。現已發現LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多個Cas13核酸酶,都可以靶向切割RNA,其中CasRx(RfxCas13d)具有最高的特異性和切割效率,也是目前發現最小的VI型CRISPR效應蛋白,能更容易利用AAV載體實現體內遞送。


圖1  CRISPR/CasRx系統敲低RNA示意圖

CasRx靶向切割RNA時,靶標RNA的兩端無需PFS,因此gRNA的設計更靈活,基本可靶向RNA的任意位置。與shRNA/CRISPRi等基因沉默技術相比,CRISPR/CasRx顯示有更高的靶向特異性和敲低效率,以及最低的脫靶效應,表明其作為基因敲低工具的獨特優勢。

CasRx與核定位信號NLS融合表達時主要定位于細胞核,能更高效敲低mRNA及在細胞核內的其他RNA。


圖2  CasRx (HA)的亞細胞定位(Konermann et al., 2018)

將gRNA設計為靶向環形RNA(circRNA)的反向剪切位點(back-splicing junction, BSJ)處時,CasRx能高效區分circRNA和其親本基因mRNA,特異靶向敲低circRNA,而不影響mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA時容易出現的效率低、脫靶或錯誤靶向mRNA,使用CRISPR/CasRx系統敲低circRNA是一個強有力的選擇和補充工具。


圖3  gRNA設計位置與circRNA/mRNA豐度(Li et al., 2020)。gRNA設計靶
向BSJ時,circRNA(紅色)的豐度最低,而mRNA(藍色)的豐度基本不變。

KDHPTM CRISPR/CasRx載體試劑盒提供多種整合型載體,將CasRx和crRNA在同一個載體中表達,只需要設計合成gRNA序列并連接插入即可,載體構建和轉染方便。試劑盒包含整合型通用NC載體,以及構建目標載體的配套試劑,無需酶切,通過一步反應即可快速構建CasRx/gRNA載體。

表1 四種載體區別及對應試劑盒貨號

貨號

載體名稱

載體骨架

U6-gRNA

CMV-CasRx

NLS

GFP

C0101-RL

pCasRx-L1

慢病毒載體

有,NC

C0101-RNL

pCasRxN-L1

慢病毒載體

有,NC

C0101-RA

pCasRx-A1

AAV載體

有,NC

C0101-RNA

pCasRxN-A1

AAV載體

有,NC


注:整合型載體為通用NC載體,含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。








產品特點
簡便:單一整合型載體同時表達CasRx和crRNA,僅需合成gRNA雙鏈,一步反應即可構建。
快速:30分鐘即可完成載體連接。
高效:連接克隆陽性率達95%以上。

運輸與保存
4℃運輸,-20℃保存,保質期一年,避免反復凍融。

產品組分

貨號

規格

試劑組分

C0101-RL

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRx-L1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRx-L1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RNL

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-L1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRxN-L1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RA

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRx-A1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRx-A1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

C0101-RNA

20 rxns

Linearized CasRx Vector, From pCasRxN-A1*

DNA Ligase Mix

10X Ligase Buffer

Nuclease-free Water

U6 Primer (10 μM)

gRNA-NC Vector, pCasRxN-A1**

40 μL

10 μL

20 μL

200 μL

100 μL

2 μg

*: Linearized CasRx Vector為對應載體去除non-targeting gRNA序列的開環載體,末端保留連接定位序列。
**: gRNA-NC Vector為含有non-targeting gRNA的通用NC載體,與Linearized CasRx Vector為同一骨架。

實驗流程

圖4  CRISPR/CasRx Knockdown Cloning Kit實驗流程圖

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