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circRNAs的巨大潛力 | 液體活檢的標志物
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-11-12 | 260 次瀏覽 | 分享到:

近日,東南大學顧萬君教授團隊Protein&Cell雜志發表綜述,總結了血液環狀RNA作為人類疾病液體活檢標志物的潛力[1]





液體活檢是一種使用人體體液作為樣本的檢測方法,可以預測和監視人類疾病的發展。與傳統的組織活檢方法相比,液體活檢具有侵害性小,實時檢測和準確性高等優勢,也因此已經應用于如癌癥、產前遺傳病、心臟病、精神分裂癥、移植排斥和感染病等疾病的檢測。至今,液體活檢的標志物有體液循環中的腫瘤細胞(CTCs)、代謝物、蛋白、血小板、胞外囊泡、cfDNAcfRNA。其中,由于RNA的動態表達以及與不同疾病狀況密切相關性,因此基于RNA的液體活檢已經越來越受到重視。


環狀RNAcircRNAs)是前體RNA通過首尾反向剪切形成的共價閉環結構。與mRNA相比,環狀RNA缺少5’帽子和3’ployA尾。circRNAs在幾乎所有的真核生物中存在,并且其表達具有組織或細胞特異性。circRNAs的異常表達與許多人類疾病相關,包括癌癥、神經退行性疾病、心血管疾病和免疫性疾病等。由于circRNAs高度穩定性、廣泛的表達以及高度特異性等特點,其正在成為極具前景的人類疾病標志物之一。


基于液體活檢標志物在精準醫療的重要性以及circRNAs作為生物標志物的優越特性,circRNAs作為人類疾病的液體活檢標志物的潛力也越來越多的被研究。因此,作者集中總結了外周血中的circRNAs作為疾病標志物的研究。為了更全面的了解circRNAs作為人類疾病的液體活檢標志物的潛力,作者從circRNAs的形成、功能、表達模式、與疾病的關系、在血液組分中的作用以及應用前景這幾個方面進行了總結。


CircRNAs的形成

circRNAs來源于前體RNA,并通過下游5’剪接位點與上游3’剪接位點共價連接形成。circRNAs主要分為3種類型:外顯子circRNAsecircRNAs)、外顯子-內含子circRNAsEIcircRNAs)以及環化的內含子RNAciRNAs)(圖1)。EcircRNAs,顧名思義,是由外顯子形成的,大多數定位于細胞質。EcircRNAs的形成有2種機制。一是在轉錄過程中前提mRNA進行部分折疊時,傳統的剪接導致外顯子跳躍并生成跨越的外顯子的套索狀RNA,隨后通過反向剪切將套索結構的中間體剪切為環狀。二是5’剪接位點與3’剪接位點通過內含子序列互補或與內含子序列互補的結合蛋白的作用拉近,隨后通過反向剪切成環。順式作用元件和反式作用因子在這個過程中都起了關鍵作用。EIcircRNAs是由于一個或幾個內含子在反向剪切過程中保留下來而形成的,因此可以被認為是ecircRNAs的中間體。CiRNA僅包含內含子,是在反向剪切過程中脫去的內含子套索分支而產生的。與ecircRNAs不同,EIcircRNAsciRNA主要位于細胞核中。


1 circRNAs的形成和功能

CircRNAs的功能

1. MiRNA結合

CircRNAs最為熟知的功能就是作為miRNAs海綿以調控miRNA的水平,進而影響miRNA靶基因的表達。例如,Cdr1as可以通過miRNA反應元件與mRNA競爭結合miR-7,進而影響mRNA的表達。

2. 蛋白調控

除了結合miRNAscircRNAs也可以與蛋白或蛋白復合物結合調控蛋白的表達和功能。主要可以分為以下3個方面:

1circRNAs能夠競爭性結合一些RNA結合蛋白(RBPs)。如第一個被發現具有RBPs海綿功能的circMbl,它能夠與MBL蛋白結合。MBL表達可以促進circMbl的反向剪接,并導致線性MBL轉錄本的表達減少,同時,circMbl可以將MBL隔離在細胞質中并阻止其執行剪接功能。

2circRNAs可以與其他RNA和蛋白質形成復合物以發揮功能。一些包含內含子的circRNAscircEIF3J circBPTF,它們可以與U1 snRNP結合形成一個RNA-蛋白復合物,進而在其母本基因的啟動子區域與RNA聚合酶IIPol II)相互作用并增強其轉錄。

3circRNAs與蛋白質的相互作用可以促進或阻斷其結合蛋白的功能。如升高circFoxo3在細胞質內的表達會影響抗衰老蛋白ID1、轉錄因子E2F1、抗應激蛋白FAKHIF1α這些蛋白的核轉運及其功能,導致細胞衰老。

3. 翻譯

一些具有內部核糖體進入位點(IRES)的circRNAs可以利用起始密碼子,以不依賴帽的方式進行翻譯,如circMblcircZNF609circRNAsN6甲基腺苷(m6A)修飾也可促進circRNAs的翻譯起始。這些circRNAs的翻譯蛋白可能與人類心臟的生理作用,癌癥的發生發展有關。


CircRNAs的表達及其在疾病中的功能

鑒于circRNAs的重要作用,它們的表達可能為理解生物學過程和疾病發生發展的潛在機制提供重要線索。至今的研究發現circRNAs哺乳生物的組織和細胞中廣泛表達,并在腦和血液中富集。circRNAs的表達水平則具有組織細胞特異性并和年齡有關,并且circRNAs的表達會隨著時間改變的動態表達,這些circRNAs的表達變化與神經元分化、神經系統發育、人類末梢B細胞分化和精子產生密切相關

circRNAs的時空表達是circRNAs生成和降解之間動態平衡的,在轉錄水平和轉錄后水平上都可以進行調節。circRNAs生成被內含子補回序列(ICSs),順式剪切原件和反式作用因子調控, circRNAs的降解miRNA引發的AGO2裂解和核酸酶介導的裂解有關,包括RNase L核酸內切酶,RNase P / MRP核酸內切酶復合物和G3BP1核酸內切酶。circRNAs生成或降解異常導致細胞或組織中circRNAs表達異常,這可能與許多人類疾病有關。如在結腸癌中,Cdr1as的過表達抑制腫瘤抑制因子miR-7的活性,從而導致致癌基因EGFRRAF1的激活。



2 外周血circRNAs可作為液體活檢潛在的疾病標志物


CircRNAs作為人類疾病標志物的優勢

現在我們已經了解了circRNAs的形成、功能、表達以及在疾病中具有重要作用,那么circRNAs作為人類疾病標志物,與其它標志物相比,它的優勢是什么?作者總結為以下3個方面:

1. circRNAs因其末端的閉環結構比線性RNA穩定。如在MCF10A人乳腺上皮細胞系中, circRNAs的半衰期至少是線性RNA2.5倍。

2. circRNAs在組織中廣泛表達,其中部分circRNAs的表達水平比起對應的線性RNA更高。

3. circRNAs的表達呈組織以及不同發育階段的特異性,更重要的是,circRNAs的組織特異性要高于其宿主基因的mRNA的組織特異性。

以上這些特征表明,當circRNAs用作生物標志物分子時,相比于其它分子,可能具有更好的分析有效性,包括分析特異性,準確性,再現性和可重復性。至今,已經有許多circRNAs被作為人類疾病的生物標志物,如Cdr1as被作為結腸癌患者的預后標志物hsa_circ_101308hsa_circ_104423hsa_circ_104916hsa_circ_100269可以預測術后III期胃癌(GC)患者的早期復發circ-AURKAcircAMACR作為神經內分泌前列腺癌的潛在診斷標志物。


血液circRNAs與液體活檢

液體活檢已成為疾病檢測領域的革命性工具,為人類疾病的診斷,預后和治療指導提供了重要支持。與尿液,唾液或腦脊髓液相比,外周血已被用作液體活檢的主要體液(圖2。血液circRNAs可分為外周血細胞外circRNAs和血液細胞中circRNAs。外周血中細胞外circRNAs是指血漿,血清和血液外泌體中的circRNAs,是不同組織細胞分泌到血液中的,因此可以指示組織的臨床特征。而血液細胞中的circRNAs是指單核細胞,紅細胞,嗜中性粒細胞和血小板以及不同血細胞混合物如淋巴細胞,PBMC和全血中的circRNAs,可以指示宿主的免疫狀態。

1. 外周血細胞外circRNAs

circRNAs在血漿和血清中廣泛表達,在這其中,外泌體和微囊泡circRNAs具有很大的診斷和預后價值。如在MHCCLM3肝癌細胞及其外泌體中,外泌體中富集的circRNAs至少是細胞中的2血小板也被證明可以選擇性釋放特異性circRNAs外泌體和微囊泡這些血液中的囊泡可以從許多不同生物系統的細胞中分泌出來,并可以通過血液循環到受體細胞,因此,細胞外circRNAs可以在許多生物學過程中發揮至關重要的作用,例如癌細胞增殖癌癥轉移耐藥性止血和炎癥。如脂肪分泌的外泌體中發現circ-DB可以競爭性結合miR-34a激活肝細胞癌(HCC)患者血漿樣品中的USP7來調節去泛素化,從而減少DNA損傷并促進HCC 細胞生長。

迄今為止,已有許多外周血細胞外circRNAs用于癌癥治療,包括早期癌癥診斷,癌癥預后和癌癥治療預測。如人血漿中的hsa_circ_0000190,可以預測肺癌患者的生存結果;血清外泌體中的circFLI1水平在小細胞肺癌患者中顯著升高,具有預測預后預測的潛力。除了異常表達的外周血細胞外circRNAs,一些融合的circRNAsf-circRNAs)也可以作為液體活檢的標志物,如F-circEA僅在EML4-ALK融合患者的血漿中表達,因此可以作為診斷NSCLC患者的液體活檢標志物。表1詳細總結了至今外周血中細胞外circRNAs研究。

表1 外周血細胞外的circRNAs標志物



2. 全血和血液細胞中的circRNAs

全血和血液細胞中的circRNAs主要在免疫反應及其調控中起著至關重要的作用(圖3)。首先,circRNAs對血液細胞的生成、分化和激活其重要的調控作用,如circANRIL可以與PES1結合以阻止前rRNA和核糖體的生成,從而通過p53激活導致巨噬細胞的生物發生。其次circRNAs可以參與抗病毒免疫反應,如circRNAsm6A修飾可抑制先天免疫,而未修飾的circRNAsK63-多聚泛素可激活RIG-I和先天免疫應答。兩種免疫因子NF90 / NF110不僅促進細胞核中circRNAs的產生,而且與成熟的宿主circRNAs結合,在細胞質中形成circRNP復合物,病毒感染后,細胞質中的circRNP復合物可以釋放NF90 / NF110,該蛋白與病毒mRNA結合以抑制病毒復制。最后,circRNAs與抗菌免疫反應也密切相關circRasGEF1B作為LPS反應的正調節劑可以在TLR4 / LPS途徑中誘導ICAM-1的表達,從而激活病原體識別和微生物感染后的炎癥反應。



3 CircRNAs參與宿主對外源病原體的免疫反應



血液細胞中circRNAs的表達失調可能有助于免疫相關疾病的發生和發展,包括自身免疫性疾病,傳染病和心血管疾病。如hsa_circRNA_001937可能通過靶向miR-26b和調節NF-κB途徑參與炎癥反應;而circPOLR2A過表達可抑制PKR激活EIF2α磷酸化和IIFN誘導的基因表達。隨著對血細胞circRNAs及其功能的認識的不斷提高,血細胞或全血中的許多circRNAs已被提議作為人類疾病的液體活檢生物標志物。如結核病患者中hsa_circ_001937PBMC中的表達明顯高于肺炎慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌患者肝癌患者PBMCs circ_0000798表達上調,并且circ_0000798的表達存活率有關hsa_circ_0057762hsa_circ_0003090,可以將SLE兒童與健康對照區分開來hsa_circ_0054633可作為糖尿病前期和T2DM的敏感而特異性的診斷生物標志物,以上這些分子都具有疾病診斷和預后標志物的潛力除了這些外,對于其他人類疾病如冠狀動脈疾病、獲得性肺炎和精神分裂癥都血液細胞中circRNAs作為疾病標志物的相關研究。表2詳細列舉了關于血液細胞中的circRNAs作為生物標志物的研究。

表2 全血和血液細胞中的circRNAs標志物


總結和未來展望


血液circRNAs的高穩定性,豐度和時空特異性表達使其成為液體活檢的理想生物標志物。但是,能夠廣泛臨床應用的生物標志物必須證明具有分析有效性和臨床效用因此,將外周血circRNAs生物標志物轉化為臨床實踐之前,仍有一些問題值得思考和解決。

1. 基于circRNAs的血液基因測試應首先在臨床相關條件下證明其有效性,另外,發現和驗證血液circRNAs生物標志物的程序也亟待標準化,包括血液收集和保存,circRNAs提取,文庫構建和計算分析。

2. 當前研究中鑒定的血液circRNAs僅是初步篩選,為了測試其臨床有效性,需要更多的臨床樣本來驗證其敏感性和特異性,尤其是區分具有相似臨床表型的患者中的表現。同時,它們在診斷疾病或預測疾病結果方面的表現也需要在臨床實踐中進行測試。

3. 需要進行進一步的研究以測試和驗證這些生物標志物在臨床實踐中的有效性,例如其為臨床決策提供信息和改善結果的能力。

盡管circRNAs作為液體活檢生物標志物仍面臨許多挑戰和問題,但將血液circRNAs標志物臨床應用中的巨大潛力能夠為我們后續的研究帶來新的啟發和選擇

 

參考文獻

1. Wen, G., Zhou, T. & Gu, W. The potential of using blood circular RNA as liquid biopsy biomarker for human diseases. Protein Cell (2020). https://doi.org/10.1007/s13238-020-00799-3


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